gordon: Фотосинтез и флуоресценция
Участники:
- Рубин Андрей Борисович– член-корреспондент РАН
Александр Гордон: ...зеленые насаждения, леса – мы дышим тем кислородом, который они вырабатывают, но два уважаемых химика сделали одно замечание. Они сказали, что если рассматривать период вегетации растения, то это похоже на правду. Но ведь растение не только живет, оно еще и умирает – умирают его листья, умирают плоды. И после гибели они связывают достаточно большое количество кислорода, потому что гниют. И таким образом, говорят они, баланс выделяемого кислорода растениями и поглощаемого кислорода сводит к нулю их деятельность в период вегетации. Как вы прокомментируете эту точку зрения?Андрей Рубин: Для того чтобы точно на это ответить, надо действительно подвести четкий баланс. Я думаю, что, может быть, если говорить о судьбе одного растения, которое живет и выделяет, потом гниет и потребляет, здесь действительно, пожалуй, могут быть сравнимые вещи. Но в целом, в глобальном масштабе на Земле, конечно, весь кислород, которым мы дышим сейчас, в геологическое время нашего существования, он весь происходит из растений. Это, я думаю, не подлежит сомнению. Другое дело и принципиальное достижение, в том числе и наше отечественное, что весь кислород, который получается в ходе фотосинтеза, он из воды. Вот это сейчас не оспаривается. Но, по-видимому, есть другие источники. Однако здесь речь пойдет о механизмах фотосинтеза.А.Г. Раз мы говорим с вами о таком феномене как фотосинтез – он для меня до сих пор непостижимым. Каким образом произошло так, что свет стал источником питания и жизни всего существующего сегодня на Земле? Ведь были же и другие эпохи. А.Р. Вопрос очень серьезный и принципиальный. Я бы даже, может быть, в качестве введения что ли, сказал несколько слов.
При всем эволюционном различии положений разных организмов, начиная от амебы до человека, между ними существует колоссальная разница. Биохимические основы, кирпичики живого – аминокислоты, нуклеотиды, все то, что нам дает биохимия, в общем, одинаковы. Вот это принципиальная была трудность в понимании эволюционного развития. Почему усложняется организация без усложнения отдельных составных кирпичиков? Ответ на этот вопрос был дан и был дан экспериментально, как ни странно. Когда было показано, что можно взять неорганические соединения – воду, CO-2, аммиак, поместить их, скажем, в кварцевую пробирку, облучить ультрафиолетом, провести электрический разряд, пропустить еще что-нибудь, дать энергию и в настоящее время нет вообще никаких препятствий к получению любых кирпичиков живого. Даже сложные сахара получаются, нуклеотиды отдельные. Это, возвращаясь к вашему вопросу, о том, что на заре эволюции, в основном, не исключительно, но в основном за счет энергии света, ультрафиолета, был осуществлен, как мы говорим, абиогенный синтез вот этих кирпичиков живого.
Возникшая жизнь питалась всеми этими готовыми веществами. Она была деторатрофна, и все было хорошо и прекрасно до тех пор, пока все не съели, грубо говоря. Дальше что делать? Либо умирать, либо тратить новые источники энергии. И тогда возник фотосинтез. И я, когда будут картинки, покажу, какие особенности механизма фотосинтеза были связаны с этим. Но если говорить о роли света, то свет второй раз пришел на помощь. То есть, за счет энергии света, я буду об этом говорить, возбуждения электронного, получается фотосинтез. И продукты фотосинтеза – это сахара, углеводы, различные другие вещества, то, чем, собственно, мы питаемся и едим.
Первый рисунок показывает схематично, как фотосинтез идет в листе. На самом деле, процесс состоит из отдельных этапов. Вдумайтесь в это. Каждый этап отличается по характерным временам на много порядков. Растение за счет фотосинтеза живет и развивается дни, годы, в зависимости от того, какое растение. АП начальный этап – аминоэнергия света – происходит за время, вдумайтесь, порядка десять в минус двенадцатой, сейчас даже говорят в десять в минус пятнадцатой секунды. Физиков не удивишь такими короткими временами, удивительно то, что это происходит в биологической системе и уже на этом коротком промежутке времени возникают биологически осмысленные процессы. То есть, это не просто некая физика, которая скрыта от всякой биологии. Я постараюсь показать, насколько это все завязано в целом.
Итак, десять в минус двенадцатой секунды, и получаются продукты фотосинтеза: фиксация СО-2, восстановление СО-2, появление сахаров, углеводов, ну и дальше, так сказать, пошло и поехало. Идет рост растения. Так вот секрет фотосинтеза, как процесса запасания энергии света (в этом отличного от других биохимических процессов) заключается на этих самых ранних этапах. И я постараюсь показать, как это получается, почему это важно не только для фотосинтеза, но и вообще для современного понимания того, что происходит в биологических белковых машинах. И потом постараюсь показать, как это можно применить на практике, буквально с сегодняшнего дня, даже в городском хозяйстве, например. А.Г. Фотосинтетические батареи?А.Р. Это один из этапов. Диагностика с помощью фотосинтеза состояния атмосферы, воды. Я буквально два слова сказал бы вот о чем. Биология – наука 21-го века. Мы сейчас будем жить в постгеномную эру. Мы расшифровали геном человека. Мы, я так понимаю, это наука в целом. Американцы в основном, как вы знаете. Что дальше? Дальше получается так, что теперь жизнь клетки – это жизнь отдельных белковых машин. И здесь произошло принципиальное понимание того, что мы не можем двигаться дальше, не понимая принципов работы этих машин. А для того чтобы понять принципы работы машин, машин в кавычки пока можно взять, это значит, что мы должны не только понимать результат начальный и конечный. Мы должны понимать, что происходит внутри.
Вот тривиальный пример: можно выбрать машину, допустим, по прочности, по скорости, по расходу бензина. Этого вам достаточно, чтобы сделать выбор, но вы еще не можете понять, что происходит внутри. Почему одна лучше другой? Вы не поймете это, если вы не понимаете, что там происходит внутри. Вот мы сейчас на этом этапе. Протеномика – наука о функциональности, функционировании белков, как составной части клетки, все это связано с проникновением внутрь машины. И работы по фотосинтезу реакционных центров ведутся уже давно. Слава Богу, уже много десятков лет насчитывает история фотосинтеза. Поэтому, как мне кажется, работа фотосинтеза выходит за рамки чисто фотосинтетических интересов. Здесь можно влезть внутрь.
Давайте следующий рисунок покажем. Вот, что происходит. Поглощается квант света, есть реакционные центры, энергия возбуждения. Дальше используется при фотосинтезе синтез органических веществ. Так вот форма использования энергии света – это организация электронного потока. Это значит, что вроде как запускают за счет энергии света поток электронов. И это происходит очень быстро. Возвращаясь к вашему вопросу, который вы задали вначале – как свет пришел на помощь второй раз. Оказалось что хлорофилл, ароматические соединения были уже давно синтезированы, ими пользовались. Но дальше необходимо было обеспечить поглощение света, возбуждение электронное и использование энергии света в фотосинтезе. Так вот, если вы возьмете хлорофилл, выделите в раствор, дадите ему электронное возбуждение, он поглотит квант света, и через пять на десять в минус девятой секунды энергия будет либо излучена в виде флуоресценции, либо дисипирует тепло. Так или иначе, за пять в десять минус девятой секунды энергия будет потеряна полностью. Если вы хлорофилл поместите в лист и захотите использовать эту энергию с большой эффективностью, то это нужно делать намного скорее, чем в естественное время, за которое пройдет естественная потеря энергии. Вот почему начальный этап фотосинтеза – разделение зарядов, отрыв электрона, который потом добежит до СО2 – это девять в минус двенадцатой, минус тринадцатой секунды. А.Г. То есть, надо успеть. А.Р. Надо успеть, потому что иначе все у вас, так сказать, оторвут. А дальше необходимо что сделать? Побежал электрон быстро, но дальше ведь его должны подхватить ферментные системы, которые, слава Богу, в эволюции уже существовали. Они работают намного медленнее. Времена у них десять в минус второй, в минус третьей секунды. И эти десять порядков надо замедлить. Вот почему электронный поток осуществляется через много промежуточных стадий.
На следующем рисунке показан этот электронный поток. Вот поглотился квант света – для энергии, для эмиграции энергии. Я не буду о подробностях здесь говорить. Идет через ряд переносчиков, пластохинон мигрирует с одной стороны мембраны на другую. Здесь ситохромный комплекс. Затем еще одна фотосистема. И выброс электрона, который уходит на надфасфат и восстанавливает его. По дороге образуется трансмембранный потенциал. Водород переносится с одной стороны мембраны на другую, получается разность потенциалов, такая электрическая батарейка заряжается. И она используется на синтез АТФ, который, как мы все хорошо знаем, это энергетическая валюта и используется во все процессах жизнедеятельности.
Так вот в кинетическом смысле это замедление электрона до времен респектабельных, почтенных, до миллисекунды, чтобы можно было нормально использовать этот электрон. И секрет фотосинтеза вот здесь находится. И в основном это есть белковая машина. Машина по переработке энергии электронного возбуждения. Из светособирающей матрицы доставлена энергия и далее идет переработка ее в энергию разделенных зарядов. Здесь две проблемы – отрыв электрона и как этот электрон переносится на большие расстояния. Ведь толщина мембраны, примерно, 50-100 эмгстрем. И он переносится за очень короткие времена. Вот на следующем рисунке мы сейчас заглянем внутрь этого электронного центра.
Вот, посмотрите, белок. Семь альфа-спиральных столбов. Внутри эти переносчики, черненьким обозначены. А вот как бежит электрон от одного переносчика к другому, идет перенос электрона. Достаточно большие этапы. А бежит он очень быстро. Вопрос – как это происходит, за счет чего он происходит быстро. Обычно в химии растворов как решается вопрос? Ударения молекул, преодоление барьера, перенос электронов, и очистительные, восстановительные реакции. Здесь все переносчики погружены в белок. Они не бегают, никакой энергии активации в обычном смысле слова нет. Поэтому начальные этапы происходят быстро, и нужно понять механизм за счет чего это происходит.
И это был принципиальный этап в понимании механизма. Оказалось, что эти процессы очень быстрые. Причем, происходит не просто какая-то диссипация энергии, а идут направленные какие-то изменения, микроконформационные. И дальше было показано, что идет так называемый туннельный перенос электрона при низких температурах. Экспериментально оказалось, что этот перенос электрона идет здесь при температурах минус сто градусов Цельсия. При температурах жидкого азота, даже жидкого гелия. Что принципиально? Что идет он, в общем, с эффективностями принципиально сравнимыми с таковыми, которые наблюдаются при комнатных температурах. И, причем, еще раз говорю, это не какая-то экзотика, которая идет только при азотных температурах. Этот барьерный туннельный перенос происходит при всех температурах. При комнатных температурах в организованных системах он идет даже с большей эффективностью, чем надбарьерный перенос в конденсированных системах.А.Г. Это же квантовый эффект? А.Р. Да. Совершенно верно. Это туннельный эффект физики, физика очень хорошо знает туннельный эффект. И здесь он происходит. Причем, идея в чем. Вот происходит туннелирование электронов из начального состояния в другое, а дальше он же может назад вернуться. А эффективность фотосинтеза начальных этапов – сто процентов. Практически сто процентов, для того, чтобы он не вернулся. За время пребывания в конечном состоянии часть энергии теряется. И за время десять в минус двенадцатой секунды он поэтому не успевает вернуться назад. И бежит дальше, ему легче в этом смысле идти дальше, чем вернуться назад. Но принципиальным является следующее. Когда приходит электрон, он не только фиксируется. Это же большая глобула, я вам показывал большой белок. Она вся претерпевает изменения вслед за приходом электрона. Вот здесь показано это схематически. Вот донор, вот аксептер. Вот у них конформация. Вот произошло туннелирование электрона. И после этого конформация начинает меняться. У донора она опять возвращается в исходное положение, чтобы принять откуда-то электрон. А у аксептера, взявшего электрон, она опять меняется, чтобы передать его дальше. Это экспериментально можно проверить. Можно поймать. Но я пока скажу, как можно себе представить аналогию. Вот, представьте себе, в цирке два акробата прыгают с одной трапеции на другую. Трапеция – это белок информационного изменения, спонтанный. А акробаты, значит, электронные. И когда эти трапеции в результате, в данном случае, свободной воли его помощника, приближаются на короткое расстояние, так, чтобы барьер для туннирования был небольшой, происходит туннирование. Акробат прыгает, хватается. Он хватается, фиксируя себя, теряя часть энергии в трении. Это потеря части энергии электрона по колебательной.
А у акробатов – трение. Проверка жестокая, намажьте лапти подсолнечным маслом, вы увидите, что получится. Но после того как он себя зафиксировал, что дальше? Характер движения трапеции меняется. Он начинает себя раскачивать. А здесь что получается? Здесь его свободная воля, так сказать, он хочет. Ему еще тут помогают. А в туннелировании ему так устроена конформация, что новое равновесное состояние получается в осмысленной конфигурации, что достигается для облегчения дальнейшего переноса электрона. И экспериментально это можно поймать. Вот, следующий рисунок показывает, как это можно сделать. Вы запускаете систему и можете ее замораживать. Можно сделать так. Вначале заморозить в темноте, а потом запустить электрон и посмотреть, как он будет там в ней гулять туда-сюда. А можно сделать по-другому. Можно начать освещать систему, она будет оживлена уже, и по дороге ее замораживать. И тогда вы в зависимости от скорости замораживания, понижения температуры, от интенсивности света, то есть от числа ударов, можете поймать разные состояния. И получите, что при одной и той же конечной температуре она у вас будет в разном состоянии и в разной конформации. И это экспериментально наблюдается действительно.
Кинетически можно показать, какая будет разная кинетика. Вот здесь экспериментальные данные. Я не хочу подробно аргументировать все это дело. Тут разная кинетика будет, но были сделаны опыты, которые показали, что действительно, структура взаимного расположения переносчиков... Опять не вдаюсь в подробности, если будет интересно, могу сказать. Мне кажется, важен смысл. На следующем рисунке я могу показать это схематически. Человечки имитируют перенос электрона. Вы их заморозили в темноте в таком положении, и они кидают электроны туда-сюда с такого положения. А теперь вы начинаете освещать и одновременно замораживать. И в зависимости от скорости освещения они взяли электрон и бегут с ним, а вы их ловите в разных местах. И вот тут-то они начинают уже играть по-другому, поскольку они попали в разные места, застыли в разных местах на пути своего естественного движения. Как биофизики у нас говорят, это принцип электронно-конформационных взаимодействий. И он не является чем-то специфическим для фотосинтеза. Вот на следующем рисунке, гемоглобин. Известно, он переносит кислород в крови. Как он работает?
У него есть четыре большие субъединицы и один атом железа, скажем, который получается так. Вы присоединяете кислород к атому железа. Атом железа вдвигается в ароматическую периферийную плоскость. Но что получается дальше? Это дает начало каскаду конформационных изменений, в результате которых каждая последующая субъединица аксигинируется с энергией активации, меньшей чем предыдущая. Корпоративное такое изменение. Что это такое, в чем принцип, почему это движущая сила?
Когда вы присоединили кислород, железо даже не поменяло эквивалентность. Но это новое электронное состояние, которое требует новой конформации. И это просто сила физического принципа поиска минимума энергии, система спонтанна, никто ее не толкает. Она спонтанно ищет новый минимум энергии и находит его на пути последовательной аксигинации субъединиц. Вот, кстати, один из принципов машинного поведения. Это использование физического принципа. Здесь нет новых физических принципов. Система их использует. Иногда видоизменяет до полной неузнаваемости. То есть, они остаются. Нарушения законов физики нет, это понятно. Но они используются. Секрет состоит не в принципах, а в том, как они используются.
Кто их придумал – понятно. Либо Бог, либо природа, что в данном случае одно и то же. И наша задача – понять, что там внутри происходит. Но гемоглобин – это классический пример такого машинного поведения, который давным-давно известен. И то, что я рассказал, является одним из хороших примеров, который иллюстрирует принцип электронно-конформационных взаимодействий, как основы функционирования макромолекулы. И сейчас дальнейшая задача- расшифровать все это дело. Я могу упомянуть многие другие, казалось бы, далекие от фотосинтеза, молекулярные машины. Например, бактерию радопсина, это фермент зрительный. Атефаза. Это все вещи, казалось бы, разные. Каналы, которые в мембранах пропускают йоны. Это все одни и те же идеи. Идеи, которые связаны с тем, что идет изменение электронного состояния. Толчок, меняется равновесие конформационное. Оно дальше начинает изменяться спонтанно, в поисках своего минимума. Это физический принцип. А это все имеет осмысленный характер, но на молекулярном уровне. Я бы даже не стал кавычки перед словом "осмысленный" здесь ставить.А.Г. Скорее, это целесообразность.А.Р. Целесообразность. Но, понимаете, мы не привыкли говорить об осмысленности, о целесообразности на уровне одной молекулы. Но вот на уровне макромолекулы, видимо, можно так говорить.А.Г. Но физики – особенно в квантовой механике – говорят ведь о "свободе воли электрона".А.Р. Я думаю, там немножко другое имеется в виду. Я не физик-теоретик, поэтому осторожно буду говорить. С одной стороны, осторожно, с другой стороны – об области, о которой слышал, но мало знаешь, можно свободно говорить. Так часто бывает. Но я тут осторожно бы о свободе воли говорил. Во всяком случае, это похоже на экскурс в область того, как взглядом люди отклоняют электрон. Ну, есть много в жизни чудес, но друг Гораций... И что там на самом деле – Бог его знает. Но в данном случае, принцип такой вполне конкретно иллюстрируется.
Сейчас речь идет о том, чтобы с помощью методов ядерного, магнитного резонанса, других методов расшифровать эти механизмы. В случае гемоглобина это все очень хорошо биохимики уже сделали. Но в других молекулярных машинах расшифровать конкретные движения, понять механизм движения еще не удалось. В фотосинтезе движение различается, как я уже говорил, в пределах одной макромолекулы. От десять минус в двенадцатой, до десять во второй секунд. Это колоссальный, принципиальный вызов молекулярной физике. Она, конечно, решит этот вопрос, вместе с биологами это будет сделано.
Но в оставшееся время я хотел бы вам, если можно, рассказать о том, как это можно применить в практике. Что это дает, вообще говоря, просто конкретно. Я несколько слов скажу. Это сложная, в общем, система – фотосинитическая. Достаточно сложная. Она не такая уж сложная, как все клетки, но достаточно сложная для процессов моделирования. И возникает вопрос, а можно ли понять, как эти начальные процессы вообще регулируются – как-то со стороны всей клетки или нет? И по каким показателям можно об этом судить. Здесь сразу речь идет о сложных системах.
Сейчас мы, пользуясь мощью современных компьютеров, стоим на пути того, что можно смоделировать поведение всей клетки. Но в данном случае, я буду говорить о поведении фотосинитической системы. И здесь встает целый ряд принципиальных вопросов регуляции сложной системы. Мы знаем принцип узкого места. Правильный принцип, но я бы сказал, упрощенный. В сложной системе много узких мест.
В фотосинтезе есть какой-то показатель, по которому можно судить о системе в целом. Показатель такой. Вот рисунок.
Флуоресценция – это та часть энергии, которая не используется в фотосинтезе. И мы можем, изучая характер флуоресценции (как она меняется при начале работы фотосинтеза) судить о том, сколько энергии запасается в фотосинтезе. Чем больше мы получаем флуоресценции, тем меньше идет на фотосинтез. Выход флуоресценции, будем так говорить, порядка одного процента. То есть, по одному проценту нам предлагается судить о том, что делалось с остальными 99-ю. Это примерно то же самое, как если бы из любопытства мы хотели бы узнать, скажем, какой бюджет у соседей, а они вас не пускают домой, чтобы вы увидели, что они там едят. Но вы можете лазить в их мусорное ведро и смотреть, сколько бутылок они выкинули или еще чего-нибудь. А потом пересчитать все те основные продукты, которые они при этом потребляют.
Вот в таком положении мы в отношении природы. Она со своего стола кидает нам флуоресценцию и говорит: "Догадайтесь, чего я там делаю в основном за столом". Так вот, начиная с фотосинтеза, вначале не удается все переработать. Электроны восстанавливают промежуточные переносчики, здесь флуоресценция большая. Потом постепенно начинает раскачиваться система. И флуоресценция уменьшается. По разности между максимальной флуоресценцией, когда все центры закрыты, и обычной, при небольшом освещении, мы можем судить о потенциальной эффективности работы фотосинтеза. И оказывается, что это можно использовать в двух отношениях.
Во-первых, существуют различные фотосинитические системы. Есть листья, фитоплантон, который в океане, и очень важно определить эффективность фотосинтеза. Для фитоплантона, для рыболовного хозяйства это вообще очень важно. Рыба пойдет туда, где есть чем питаться, где фитоплантон. Это очень важно. А с другой стороны, хлорофилл, который сидит в мембране, как я уже говорил, он очень чувствителен к всевозможным антропогенным загрязнениям – гербициды, еще что-нибудь, что проникает в клетку. И когда в клетку они проникают, они меняют состояние мембран, а, как следствие, меняется флуоресценция хлорофилла. Как правило, она портится – в том числе и состояние хлорофилла, а флуоресценция увеличивается.А.Г. Запасается меньше.А.Р. Да, совершенно верно. И это можно использовать. С одной стороны, разность между максимальной и нулевой флуоресценцией есть показатель эффективности работы фотосинтетического аппарата. И можно в автоматическом режиме измерять эту интенсивность флуоресценции в морях и океанах. Я покажу некоторые примеры, и что это дает. А с другой стороны, можно посмотреть, как это регулируется всей клеткой. И потом этот показатель можно использовать, для того чтобы посмотреть – все ли в порядке в фотосинитической системе? И как следствие, а все ли в порядке в окружающей среде, поскольку растения, фитоплантон, они чувствуют, что происходит вокруг и могут быть просто индикатором состояния. Вот у нас на кафедре мы ведем уже давно большие работы. Вообще все, что я рассказываю – это результат работы, в основном, моей кафедры, конечно, но и большого количества сотрудников. Я просто не могу перечислить все фамилии моих друзей и коллег сейчас. Но поскольку я не научный доклад делаю, я думаю это позволительно.А.Г. Они вас делегировали.А.Р. В общем, я думаю, они проверят, правильно ли я здесь все говорю.
Так вот, на следующем рисунке я вам покажу один пример. Вот корабль и маленький аппаратик здесь показан, который мы опускаем в воду и можем в автоматическом режиме измерять интенсивность процесса фотосинтеза начальных этапов и смотреть, что там происходит. Я вот такой вопрос, допустим, задам. Что будет, если мы будем освещать клетку фитоплантонную, но заставим ее голодать при этом? Не дадим ей фосфора, азота. Ответ правильный, казалось бы, такой. Будут происходить первичные процессы, будет происходить разделение зарядов, при этом будут накапливаться АТФ, но роста не будет – потому что не из чего строить тело. Но подождет клетка хороших времен, когда у нас появится фосфор, азот, но не все же время она будет голодать. И тогда эта АТФ будет использована, клетка будет расти. Это логически правильный ответ, но не верный.
Потому что в клетке существует огромная опасность. А именно. Если у нас есть избыток электронов и избыток энергии электронного возбуждения, не использованные в данный момент времени, то кислород, который везде находится, в том числе, кстати, выделяется при фотосинтезе, как побочный продукт фотосинтеза, будет активироваться, и восстановленный кислород или возбужденный кислород будет вызывать разрушение мембран.
Кстати, все эти разговоры на счет озонной дыры – это, видимо, была, так сказать, хорошо проведенная дезинформация, для того чтобы хладагенты заменить. Но само по себе это физически обосновано. Озон, который экранирует от проникания ультрафиолета, мешает активации кислорода. Если вы будете слишком много загорать, у вас появится рак кожи, у вас будет выцветание фотодинамических красителей. Это то, что угрожает самой клетке. Я бы здесь провел сравнение с недоброй памяти Чернобыльской АЭС. Потому что там тоже скорость выделения энергии в процессе реакции оказалась большей, чем скорость замедления, и произошел взрыв.
Здесь то же самое. Надо не дать возможности активировать кислород. Как это клетка делает? Это колоссальный пример. Следующий рисунок, пожалуйста. Если кислород активируется, то происходит разрушение клетки. Понятно, чем это всем нам грозит. Так вот, оказывается, клетка делает следующее, когда слишком много света, а она голодная. Она электрон на самых ранних этапах направляет назад за очень короткое время. Время меньшее, чем время, нужное для активирования кислорода. И это происходит не только в лабораторных условиях, а прямо в природе. Вот посмотрите. Эти наблюдения проводились в Средиземноморье, но у нас в Подмосковье то же самое происходит. В восемь утра солнца мало и пищи вполне достаточно. В этом смысле они голодают. Пища соизмерима с количеством квантов. Я очень грубо говорю, но понятно. А.Г. Пропорция верная.А.Р. Не слишком много квантов, не захлебывается она. И интенсивность фотосинтеза большая. А вот поднимается солнце, 12 часов дня, интенсивность фотосинтеза падает и становится минимальной. Что значит падает? Электрон обращается назад. Это сопровождается увеличенным свечением – не дать кислороду схватить эту энергию, не разрушить клетку. А потом, когда солнце заходит, опять все возвращается назад. Вот и у нас то же самое. Можно на следующем рисунке это увидеть. Вот посмотрите, Можайское водохранилище. Ну, не Адриатическое море, но свои прелести здесь тоже есть. На глубине одного метра в десять часов утра интенсивность фотосинтеза максимальная. Не так уж много солнца у нас в Подмосковье в десять часов утра. Но когда в два часа дня интенсивность солнца уже достаточно большая и на глубине одного метра его слишком много – вот тут интенсивность фотосинтеза упала. А на глубине двух метров она как раз стала максимальной. То есть, они активно это регулируют.
Я тут не позволю себе вдаваться в механизмы, но чтобы остаться, так сказать, в рамках жанра, скажу, что здесь идет восстановление пластахинона, о котором я говорил. Только эти научные слова произнесу, глубже не буду вдаваться. За счет того, что появляется большой отрицательный заряд на пластахиноне, за счет ликростатического отталкивания электроны не успевают, им не дают возможности уйти в цепь, кислород не успевает активироваться за это время. Это что касается активность фотосинтеза. Теперь как использовать эти показатели для того, чтобы определить степень антропогенного загрязнения.
Можно просто измерять эту интенсивность фотосинтеза начальных этапов по переменной флуоресценции, измерять в режиме реального времени, в реальных условиях. Я вам покажу несколько примеров, которые интересны. Это мы делаем на нашей кафедре. Мы заключили договор с мэрией Москвы и провели обследование различных деревьев. Результаты я вам потом покажу. С нашим шариком мы проехали на трамвайчике по Москва-реке. Что мы получили. Вот посмотрите. 40 километров мы проехали по Москва-реке. Растет количество водорослей в Москва-реке по мере продвижения в городскую черту. Почему? Вообще, они живут, так сказать, и процветают там. А вот интенсивность фотосинтеза остается приблизительно постоянной. Их много, но все они себя чувствуют неплохо. Но вот в некоторых местах, а именно, в устье Яузы, и в устьи еще одной реки... Не помню, не могу разобрать...А.Г. Завод имени Лихачева и Южный порт. Самые экологические неприятные места.А.Р. Да, да, да. Вот посмотрите, что мы видим. Резкое уменьшение интенсивности фотосинтеза. Мы мэрии предлагали сделать все бесплатно, дайте нам трамвайчик, мы проедем по Москва-реке и покажем, где неучтенные вами сбросы вод. В режиме реального времени. Но – это к вопросу о востребованности науки – дальше платонических разговоров дело не пошло. А.Г. Но данные же вы получили все-таки.А.Р. Ну, одно дело эти данные. Другое дело, что с ними делать. Мы большое беспокойство вызываем. Спокойнее гораздо знать то, что есть и не знать ничего больше. Я думаю, тут понятно, что я хочу сказать. Не хочу кидать ни в чей огород камешки, но мы можем это сделать. Пока не получилось.
Другая проблема есть. Скажем, проблема цветения водорослей, забивка труб сточных, еще чего-то такое. Это очень важный момент. Вот на озере Байкал важно предсказать время цветения. На озере Байкал активное цветение начинается, примерно, где-то в конце февраля и идет в марте. Ну, это известно. А вот, посмотрите, как идет интенсивность фотосинтеза на начальных этапах. Она начинает подниматься за два-три месяца до цветения. Они начинают готовиться. Представьте себе, насколько это важно знать в данном конкретном водоеме или в какой-нибудь системе, где идет, возможно, загрязнение – знать и заранее все это предсказать. Насколько это важно.
Вот переменные флуоресценции уже на городских лесонасаждениях. Ну, мы знаем, что в Москве гибнут десятки тысяч деревьев. Причем, как они гибнут? Оно стоит, стоит, потом оно, так сказать, довольно резко гибнет. И потом начинается постфактум – выяснение. А почему у нас здесь было вредное место, еще чего-то такое. Вот мы прошли улицу Марии Ульяновой и измерили эту переменную флуоресценцию. У нас есть небольшое ноу-хау, как можно мерить переменную флуоресценцию не только на листьях, но и на коре. Это зимой даже можно сделать, когда никаких листьев нет. Это так вот, маленький секрет. И вот красным обозначены опасные места, они совпадают либо с автобусной остановкой, либо с каким-то местом, где было какое-то строительство, либо где автобусы дизели свои не выключали, вот что-то в таком духе. И можно же провести сканирование. Более того, при планировании, скажем, фасадов каких-то можно с точностью до одного-двух метров показать безопасное расстояние для лесонасаждений. А.Г. Кроме того, выбрать, наверное, и породы деревьев, которые будут устойчивы. А.Р. Абсолютно точно. Представляете, какая проблема. Вы дорогие какие-то саженцы привезли, да еще они откуда-нибудь с юга. И вы не знаете, какие приживутся тут, в наших условиях. А мы по этой величине в зависимости от температурного воздействия их можем отобрать. Причем, с большой точностью, в слепых опытах мы это делали.
С мичуринцами у нас договор был. Мы дали им соответствующий прибор, маленькую такую прищепочку, как мы ее называем, спектроскопическую, с помощью которой они могут определить зимостойкость яблоневых саженцев. И они это используют активно, это очень хорошая вещь. Еще один пример я вам покажу. Вот, допустим, антропогенное загрязнение – соли тяжелых металлов. Вообще проблема питьевой воды – известная вещь. Бывает же ситуация такая, когда по химическим анализам все хорошо, а в целом сочетание вредное. Ну и обратная картина. А.Г. Кроме того, динамические характеристики важны. Сейчас все хорошо, а через две минуты все плохо. А.Р. Конечно, конечно. По частям все вроде хорошо, а общее впечатление отвратительное. Как в известном анекдоте о впечатлении делегации по поводу завода. "И то хорошо, и это хорошо, а общее впечатление – отвратительное".
Итак, здесь водоем с разной концентрацией йонов меди. Они небольшие в том смысле, что количество клеток – зеленая линия – не меняется. То есть, никто еще не гибнет, все хорошо. А по переменной флуоресценции уже идет падение. Это идет отравление. За много дней до того, как произошло падение клетки. Это есть экспресс-диагностика, которую можно использовать. Поэтому я сейчас пользуюсь тем, что мы с вами говорим, и мы это продолжение повторяем. Мы готовы это сделать, мы готовы обучить персонал. Это не простые измерения, это не на весах взвесить. Это более сложная вещь. Мы готовы, мы работаем в университете, это наши обязанности. Нам это интересно. И это можно сделать. Растения стоят на перекрестке дорог и никуда не бегут. Это естественные часовые. Фитапланктон в Москве-реке живет, и он показывает, что там происходит. И это нужно использовать. И это не наша только выдумка, весь мир перешел на спектральный метод автоматического мониторинга в режиме реального времени. Ну, и, хоть здесь, может, мы не отстанем. Я уж не знаю.
И последний пример я хотел бы привести такой. Вы знаете о проблеме экологически чистых источников энергии – водород. Уже автомобили на водородном топливе показывают. Откуда брать его? Я думаю, что перспективны будут, конечно, химические дешевые системы. Биологические тоже не сбрасываются со счета. Водоросли выделяют водород. Кстати говоря, некоторые водоросли его выделяют, когда начинают голодать, когда им некуда девать электроны. И для того чтобы они не достались кислороду, специальный фермент гидрогинеза передает ион водороду. Выделяется молекулярный водород. И, как побочный кислород, молекулярный водород. В культиваторах важно определить время, когда это начинается.
И здесь показано, что начало выделения водорода совпадает (мы недавно это открыли в совместных работах с американцами) с резким падением фотосинтеза. За десять – пятнадцать минут, а времена здесь – часы. Десять, двадцать, сорок часов. За пятнадцать минут резкое падение фотосинтеза, как предварительная такая подготовка. Они показывают – сейчас будем выделять водород. Резко уменьшаем фотосинтез, и будем электроны на водород отдавать.
Заключая, я бы сказал так. Если вернуться опять к проблеме сложных систем, то мы ведем, уже начали работу по моделированию этой системы в целом. Мы знаем, как она устроена. Мы знаем, какие там константы, из экспериментов знаем. В этих условиях методика математического моделирования сложных больших моделей очень перспективна. Потому что то, что мы определим путем подбора констант, с большой вероятностью можно считать, что это соответствует реальным системам. Это эвристическая ценность моделирования, когда вы можете теоретически узнать то, что или трудно экспериментально узнать, или в голову даже не приходит. Это достаточно ценная вещь.
Но в принципе, оказывается, что одна из основных трудностей состоит в том, что мы привыкли считать, что константы неизменны. А вот то, что мы здесь видели, показывает, что возвращение части электронного потока, как ответ на реакцию, означает, что меняется узкое место. Изменяются константы. И я хотел бы это проиллюстрировать немножко несколько фривольным что ли рисунком.
Все бегут на лекцию в Московский университет с пересадкой в метро. А в метро узкое место – это эскалатор. Что это значит? Сколько бы вы поездов не добавляли сюда, если вы не увеличите скорость движения по эскалатору, у вас скорость вообще не увеличится. Вот так регулируется эта система. Хотите увеличить скорость прибытия на лекцию, увеличьте число эскалаторов. Это обычный принцип узкого места. И еще здесь есть сигнал обратной связи. То, что здесь узкое место, передается на вход и говорят: не теряйте время, займитесь чем-то еще. Идет изменение топографии системы. Вот в чем трудность моделирования больших систем. Они вроде как стационарные, но константы там могут меняться и, в принципе, на любом этапе. Ну, не на любом, конечно. Но вот здесь показано, куда они бегут. Побежали в библиотеку чего-то читать. В кино тоже – неплохо. Могут бизнесом заняться – тогда конец науке. Потому что в бизнес из науки есть путь, а из бизнеса в науку я чего-то примеров конструктивного возвращения не знаю. Но будем надеяться, что сила и образования нашего, и традиций научных такова, что нам еще не скоро удастся похоронить науку, несмотря на все недобрые усилия.А.Г. А сколько времени пройдет от создания компьютерной модели той сложно действующей системы до попыток синтезирования такой системы? И вообще возможно ли это или это фантастика? А.Р. Вы знаете, эта проблема сейчас встала. Я могу вам сказать, что у нас на кафедре есть опыт моделирования. Вообще у нас в стране, надо сказать, сильная школа математического моделирования. У нас на кафедре есть небольшая группа, еще сильная группа в Пущино есть, в физическом институте. Так что с мозгами у нас все в порядке всегда было. И сейчас там с компьютерами тоже неплохо. Но я вам скажу так. Я думаю, что в целом смоделировать клетку, – до этого еще, конечно, далековато. И здесь даже не в том дело, что компьютерной мощи может не хватить, а в том, что мы еще не все знаем. Слишком большой произвол будет. Если вы посмотрите на карту клеточного метаболизма, голова кругом идет, конечно. Это нереально. Нереально потому, что мы еще далеко не все константы знаем и не все знаем. Но отдельные блоки, функционально осмысленные и биологически имеющие значение – конечно, пришла пора это делать. Вот мы сейчас займемся фотосинетическим моделированием, есть и другие проекты. И я думаю, года через два-три мы получим реальные результаты.
Max_Evil
Свет как питательный субстрат. Фотосинтез возник в процессе эволюции, придя на смену гетеротрофному способу питания, в котором изначально потреблялись абиогенно синтезированные питательные вещества. Можно сказать, что фотосинтез обязан своим "происхождением" своего рода экологическому кризису, возникшему в результате исчерпания на определенном этапе развития жизни органических ресурсов планеты. В настоящее время фотосинтез – главный процесс, обеспечивающий энергией все живое на Земле за счет энергии света. Достаточно сказать, что ежегодно в результате фотосинтеза на Земле образуется около 150 млрд. т органического вещества, усваивается 300 млрд. т СО2 и выделяется около 200 млрд. т свободного О2. Благодаря фотосинтетической деятельности первых зеленых организмов в первичной атмосфере Земли появился кислород, возник озоновый экран, создались условия для биологической эволюции.
На начальных стадиях эволюции в качестве уловителей энергии света стали использоваться порфириновые молекулы ароматических соединений, которые до этого уже существовали на Земле. Теперешние фотосинтезирующие организмы обязательно содержат магнийпорфириновые пигменты ? хлорофиллы. Известно больше десяти видов хлорофиллов, но все они поглощают свет видимой и инфракрасной частей спектра от 300 до 1100 нм. Для всех хлорофиллов характерно наличие нескольких максимумов поглощения и флуоресценции.
Первичные процессы фотосинтеза. Суммарный процесс фотосинтеза высших растений можно разделить на две взаимосвязанные стадии: световую и темновую. Со времен К.А. Тимирязева было ясно, что центральное место в системе фотосинтеза занимают первичные фотопроцессы. Это реакции, в которых энергия света, поглощенная пигментами фотосинтезирующего организма, преобразуется непосредственно в энергию химических связей продуктов фотосинтеза. Раньше систему первичных процессов фотосинтеза называли системой световых реакций, где поглощение квантов света приводит к тому, что энергия электронного возбуждения молекул хлорофилла запасается в виде химической энергии молекул восстановленного никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФ) и аденозинтрифосфата (АТФ). Эти соединения являются конечными продуктами световой стадии фотосинтеза. Они необходимы и достаточны для того, чтобы в темноте (без непосредственного участия света) произошло восстановление СО2 в цикле Кальвина.
Основная проблема состоит в том, каковы механизмы этих начальных стадий фотосинтеза. Именно здесь находятся "энергетические ворота жизни", где происходит стыковка физических, биологических, биохимических, физиологических процессов, которые и создают энергетическую основу жизни на Земле и сопровождаются выделением кислорода в качестве побочного продукта фотосинтеза. Изучение системы первичных процессов требует усилий специалистов различного профиля: физиологов растений, биохимиков, биофизиков, физиков, математиков.
По сравнению с другими биологическими системами первичные процессы фотосинтеза - очень своеобразный объект, где происходит непосредственное взаимодействие физических процессов (электронного возбуждения, транспорта электронов) с биологическими. Характер изменения первичных стадий фотосинтеза непосредственно отражается в изменении флуоресценции хлорофилла в фотосинтетических мембранах клеток. Флуоресценция хлорофилла способна обеспечивать резонансный перенос энергии, однако в то же время по так называемым индукционным кривым флуоресценции представляется возможным судить не только об эффективности энергозапасающих процессов фотосинтеза, но и о состояние мембран хлоропластов или даже экологических систем.
Структурно-функциональная организация электронтранспортной цепи фотосинтеза. В первичных процессах фотосинтеза кванты света поглощаются пигментами в двух фотохимических системах - ФС1 и ФС2, которые функционируют последовательно, передавая электрон по цепи промежуточных соединений. Источником электронов служат молекулы воды, которые разлагаются с выделением кислорода. Основная форма запасания энергии света - организация электронного потока, который представляет собой не просто набор отдельных окислительно- восстановительных реакций, а направленную цепь транспорта электронов между переносчиками, локализованными в фотосинтетических мембранах. Главная особенность первичных процессов состоит прежде всего в том, что начальные этапы переноса электрона - отрыв электрона от хлорофилла, восстановление первичного акцептора - происходят в реакционных центрах (РЦ) очень быстро, за несколько пикосекунд (3.10-12 с). Эффективность начальных процессов в реакционных центрах очень высока. Она была определена экспериментально и оказалась близкой к единице - почти 100%.
Реакционные центры (РЦ) – это "приводные ремни" фотосинтеза, его ключевое звено. Они представляют собой "белковую машину", в которой происходит трансформация энергии электронного возбуждения. Принципы работы этой машины лежат также в основе функционирования других энергопреобразующих макромолекулярных комплексов трансформации энергии (АТФ-синтетазы, бактериородопсины, активных центров ферментов). Различают активное "открытое" и пассивное "закрытое" состояния РЦ, отличающихся на несколько порядков ( 300 пс и 1,6 нс ) по средним временам флуоресценции хлорофилла в них in vivo.
В частности, своеобразие белково-пигментных комплексов бактериородопсина (БР) состоит в том что в них белок БР функционирует как светозависимый протонный насос. Он обеспечивает образование электрохимического градиента протонов на поверхности мембраны клетки, который, в свою очередь, служит для аккумулирования энергии. Первичная работа, производимая градиентом, заключается в синтезе АТФ через анаэробное (фотосинтетическое) фосфорилирование. Проводя эксперименты in vitro с упорядоченными пленками БР, выделенным из пурпурных мембран фотосинтезирующих галобактерий, была установлена возможность практического использования высушенных термостойких пленок этого белка для интеграции их с оптическими токопроводящими подложками. Это, в свою очередь, открыло практические возможности применения БР для разного рода электронных устройств, детекторов, датчиков и биотехнических информационных систем.
В системе первичных процессов фотосинтеза высших растений РЦ обеспечивают перенос электрона с одной стороны мембраны на другую. В этом смысл работы РЦ фотосинтеза. Между макромолекулярными комплексами РЦ находятся подвижные переносчики, которые, получив электрон от фотосистемы 2, переносят его к фотосистеме 1. При переносе электронов внутри тилакоида одновременно накапливаются протоны, что лежит в основе движущей силы образования АТФ.
Каковы же механизмы транспорта электрона, которые обеспечивают его эффективный и направленный перенос в макромолекулярных комплексах РЦ? Очевидно, здесь не годятся механизмы, связанные с обычными физико- химическими реакциями в растворах, где процесс происходит в результате столкновения молекул за счет избытка их кинетической энергии, достаточного для преодоления активационного барьера. В вязкой фотосинтетической мембране невозможен свободный пробег больших молекул на многие межмолекулярные расстояния, которые бы обладали избытком кинетической энергии. Здесь переносчики уже исходно взаимно ориентированы в макромолекулярных комплексах.
Важно подчеркнуть, что макромолекулярные комплексы - это та форма организации фотосинтетического аппарата, которая отвечает за общий характер и эффективность первичных процессов фотосинтеза. Вопрос о том, каков механизм переноса электрона в этих условиях, имеет важное значение. Электрон не просто переносится между переносчиками, а совершает работу по восстановлению соединений НАДФ и образованию АТФ в световой стадии. Понять, как происходит перенос электрона, - значит понять, как работает электрон в реальных условиях.
Экспериментально установлено, что начальная фотохимическая реакция в РЦ – появление электрона на первичном акцепторе (I) и положительного заряда на фотоактивном хлорофилле (P) - происходит очень быстро и с большой эффективностью:
h? + PI > P *I > P +I -
Каким же образом происходит запасание энергии в РЦ? Поглощение света переводит молекулы в электронно- возбужденное состояние. Естественное время жизни возбужденного состояния ароматических соединений, в том числе хлорофилла, составляет величину порядка 5 нс (5 х 10- 9 с). Известно, что за это время энергия электронного возбуждения молекулы либо переходит в тепло, либо испускается в виде кванта флуоресценции. Для того чтобы эта энергия с большой эффективностью использовалась в РЦ фотосинтеза, очевидно, необходимо, чтобы это происходило за время короче 5 нс. В противном случае не будет шанса "поймать" и использовать энергию возбуждения в фотосинтезе, а она будет растрачиваться в тепло или флуоресценцию. Для того чтобы обеспечить высокую (около 100%) эффективность реакции Р*I > PI- в фотосинтезе, необходимо, чтобы такой процесс происходил гораздо быстрее, чем испускание света флуоресценции. Действительно, в реальности это время составляет всего несколько пикосекунд (10- 12 с).
Дальнейший перенос электрона по цепи фотосинтеза приводит уже к восстановлению других переносчиков и в итоге к появлению конечных продуктов световой стадии (НАДФН и АТФ), которые вступят в обычные ферментативные реакции. Известно, что среднее время ферментативных реакций находится в диапазоне миллисекунд (10-3 c). Увеличение времени реакции от пикосекунд в РЦ фотосинтеза до миллисекунд в ферментативных процессах составляет девять порядков (т.е. в миллиард раз ). Это колоссальный перепад времен, который необходимо перекрыть для сопряжения световой и темновой стадий фотосинтеза. Именно поэтому первичные процессы организованы по принципу электронного потока, который постепенно замедляется, делая доступным электроны на последних стадиях для обычных ферментативных процессов.
Фотоконформационный переход. Для того чтобы происходил эффективный перенос электрона между донорными и акцепторными группами переносчиков, необходимо, чтобы они были сориентированы определенным образом, то есть пришли в контактное состояние. Именно для формирования этого исходного контактного состояния необходимы определенные крупномасштабные (1-1,5 A ) смещения молекулярных групп. На эти процессы можно влиять, модифицируя состояние образца: понижая температуру, обезвоживая его. Очевидно, в этом случае уменьшается количество пар контактных молекул- переносчиков, которые способны к переносу электрона.
Известно, что приход электрона в равновесную молекулу акцептора изменяет ее электронное состояние, а поскольку конформация молекулы должна соответствовать ее электронному состоянию, то при этом исходная конформация становится неравновесной. В результате возникают внутримолекулярные силы, которые стремятся привести молекулу в новое конформационно-равновесное состояние в соответствии с ее новым электронным состоянием. Тем самым индуцируется каскад конформационных изменений.
Это было продемонстрировано в опытах на РЦ, где молекулы пигмента и первичного хинона обмениваются электронами (Р - QA). Если понизить температуру такого образца в темноте, а потом осветить образец, то при освещении наблюдается окисление пигмента (Р*QA > Р+QA), а затем при выключении света можно видеть его восстановление (Р+QA > РQA) по двум путям: быстрому и медленному ( быстрая и медленная компоненты восстановления Р > QA и QA > Р ). При низких температурах быстрая компонента восстановления Р+ преобладает над медленной. При комнатной температуре высокоэнергетическое состояние акцептора также заселено и возврат на пигмент из него происходит по медленной компоненте.
Однако ситуация принципиально меняется, если понижать температуру не в темноте, а одновременно с освещением образца. При освещении электрон попадает на хинон, где из- за изменения электронного состояния хинона меняется и конформационное состояние всей молекулы этого акцептора. Поэтому с первых моментов освещения, когда только началось охлаждение, начинается и каскад конформационных изменений. Затем при дальнейшем понижении температуры мы "ловим" объект на разных стадиях этих конформационных изменений, вызванных действием света. В зависимости от скорости понижения температуры и интенсивности света можно зафиксировать объект на том или ином состоянии, соответствующем глубине конформационного перехода. Кинетика восстановления Р* при разных температурах в этих образцах будет совершенно иной. Она определяется возвратом электрона из разных точек на пути конформационного перехода.
Таким образом, полученные результаты показывают, что скорости реакций переноса электрона зависят от того, в каком конформационном состоянии находится соответствующий переносчик. Конформация переносчиков меняется на свету, значит, и константы скоростей реакций в цепи фотосинтеза будут зависеть от условий предварительного освещения.
Существуют физические и математические модели, которые позволяют описать такие конформационные движения. На основании теоретической обработки экспериментальных данных можно определить масштабы и времена смещений, внутримолекулярную вязкость. Необходимо также отметить следующее. Обычно перенос электрона по цепи фотосинтеза или митохондриальной дыхательной цепи представляется в виде движения шарика, катящегося вниз по лестнице, где каждая ступенька – энергетический уровень переносчика. В такой модели при переходе электрона на новую ступеньку часть энергии электрона либо расходуется в тепло, либо запасается в АТФ. Теперь эти представления в свете полученных результатов следует дополнить следующим образом. Каждый раз, попадая на соответствующую ступеньку, шарик, условно говоря, под действием силы тяжести вызывает поворот ступеньки (в результате электронно-конформационных взаимодействий) в таком направлении, что облегчается его движение дальше на следующую ступеньку. Этот поворот происходит достаточно быстро, поэтому вероятность обратного перехода остается намного меньше вероятности перехода вперед и весь транспорт становится эффективным и необратимым. Таким образом, переходы электрона неотделимы от конформационного состояния переносчиков, и, более того, они возможны лишь в том случае, если есть внутримолекулярная подвижность в белковых частях переносчиков.
Механизм переноса электрона. В реакционных центрах происходит быстрый (150 пс) перенос электрона на большие межмолекулярные расстояния, с одной стороны мембраны на другую (до 50 A) Активная роль в этом процессе принадлежит белковому окружению молекул-переносчиков. Дело в том, что белок не является пассивным местом расположения переносчиков, а сам принимает активное участие в транспорте. Состояние белка играет непосредственную роль в обеспечении электронного транспорта в цепи фотосинтеза.
Механизмы переноса электрона изучают в биофизике методами низкотемпературной фиксации объекта, которые позволяют исследовать кинетику процессов при пониженных температурах. Принципиальным результатом, который показал своеобразие первичных процессов фотосинтеза, является то, что процесс переноса электрона при низких температурах (- 196 С) протекает в реакционных центрах с высокими скоростями. Впервые это было установлено в начале 60-х годов при изучении реакции окисления цитохрома (вторичный донор D) фотоактивным бактериохлорофиллом (Р870) после действия кванта света. Данные о температурной зависимости скорости процесса показывают, что перенос электрона в этой системе совершается при температуре ниже 100 К, то есть при температуре жидкого азота со скоростями, в общем близкими к скоростям переноса при комнатной температуре.
В основе этого лежит так называемый туннельный эффект - квантовомеханическое явление. Электрон переносится между двумя молекулами переносчиков, разделенных барьером, в условиях, когда энергия электрона недостаточна для преодоления этого барьера. В классической физике в этих условиях перенос электрона был бы невозможен, поскольку при низких температурах он не может получить необходимую для преодоления барьера энергию. Квантовомеханический эффект состоит в том, что в силу своей волновой природы электрон как бы просачивается под барьером. Отсюда и название - туннельный перенос. Электрон туннелирует от одного переносчика к другому с вероятностью, которая зависит от ширины и высоты барьера: она экспоненциально уменьшается с увеличением этих параметров.
Принципиальным обстоятельством является то, что в экспериментах перенос электрона в фотосинтетической цепи в реакционных центрах происходит с очень большой эффективностью и, следовательно, он должен происходить необратимо. Однако туннельный перенос возможен в принципе как от донора к акцептору, так и в обратном направлении. И в случае, если молекулы обладают одинаковыми размерами, эффективность переноса электрона составляет всего около 50%. Для того чтобы сделать перенос необратимым, нужно, чтобы во время пребывания электрона на молекуле акцептора он успел потерять часть энергии. Тогда совпадение уровней между донором и акцептором будет нарушено. Если при этом электрон успел локализоваться на акцепторе, то он уйдет дальше в цепь переносчиков и перенос на этом участке станет необратимым.
Процесс туннелирования лежит в основе переноса электрона на многие межмолекулярные расстояния в фотосинтетических мембранах. Надо отметить, что туннельный перенос настолько эффективен, что происходит даже при комнатной температуре с большей эффективностью, чем обычный надбарьерный активационный перенос.
Современная биофизика показывает совершенно определенную взаимосвязь между внутримолекулярной подвижностью белка РЦ и переносом электрона. Например, при понижении температуры происходит некоторое замедление переноса электрона на участке между первичным и вторичным акцепторами QA > QВ. При этом одновременно уменьшается и внутримолекулярная подвижность белка РЦ, которая была измерена с помощью специальных методов радиоспектроскопии.
Однако существуют обратные реакции транспорта электронов, которые сопровождаются люминесценцией (флуоресценцией) хлорофилла. По величине флуоресценции, которая соответствует потерям поглощенной энергии света, можно судить об эффективности запасания энергии в начальных стадиях фотосинтеза.
Флуоресцентные методы в экологическом мониторинге. Характер изменения первичных стадий фотосинтеза непосредственно отражается в изменении флуоресценции хлорофилла в фотосинтетических мембранах клеток. Флуоресценция хлорофилла является пока единственным показателем, который позволяет исследовать в живых объектах протекание фотохимических реакций, связанных с работой фотосистемы 2 высших растений (ответственной за разложение воды и выделение кислорода ) – системы, наиболее чувствительной к факторам внешней среды таким как: экстремальные температуры, избыточная освещенность, соли тяжелых металлов, высушивание, повышение содержания солей в питательной среде.
При активном фотосинтезе, когда все РЦ находятся в открытом рабочем состоянии, в условиях слабого освещения почти вся поглощенная энергия света используется в процессе фотосинтеза. Поэтому интенсивность флуоресценции хлорофилла в клетке намного ниже, чем в растворе. Однако и здесь небольшая часть энергии электронного возбуждения (не более 3%) переходит в энергию света флуоресценции в виде так называемой фоновой флуоресценции F0 . Как правило, в нормальных условиях величина F0 мала, что говорит об активном использовании клетками энергии поглощенного света. Но если при каких-либо воздействиях нарушается состояние фотосинтетических мембран, то центры (РЦ) переходят в неактивное (закрытое) состояние, когда происходит прекращение потока электронов в первичных процессах фотосинтеза. В этих условиях поглощенная энергия света уже не может использоваться в фотосинтезе, поэтому и флуоресценция хлорофилла возрастает. Можно полностью вывести из рабочего состояния РЦ, например при действии ингибитора потока электронов диурона. В этом случае флуоресценция сильно возрастает и приближается к своим максимальным значениям Fm . Заметим, что закрыть центры, можно создавая также избыточную освещенность клеток, когда происходит световое насыщение фотосинтеза. Фотосинтетическая цепь переноса электрона как бы захлебывается от избытка поглощенной световой энергии, переводя все большую часть поглощенной энергии света в флуоресценцию.
Флуоресценция фитопланктона. Для исследования флуоресценции фитопланктона в природных водоемах на кафедре биофизики биологического факультета МГУ разработан специальный прибор (погружной зонд- флуориметр), позволяющий проводить измерение величин F0 и Fm в водоемах на разных глубинах (до 200 м). Принцип действия зонда состоит в том, что при освещении первой слабой вспышкой света порции фитопланктона, в зонде измеряется величина фоновой флуоресценции F0 . Затем при действии второй мощной вспышки света в клетках происходит кратковременное насыщение всех РЦ, которые не успевают утилизировать поглощенную энергию света и переходят в результате этого в закрытое состояние. В этих условиях флуоресценция хлорофилла возрастает до максимальных значений Fm . Таким образом можно определить значения переменной флуоресценции Fv = Fm - F0 и отношение Fv / Fm , которые отражают эффективность запасания энергии света на начальных этапах фотосинтеза. Поскольку величина F0 зависит от количества хлорофилла в клетках, то это можно использовать для определения его концентрации. По величине F0 можно также определять и количество биомассы фитопланктона, которое пропорционально содержанию хлорофилла в клетках. Определение величин F0 и Fv / Fm позволяет выявить ситуации, когда в водоемах имеется много фитопланктона (F0 велико), однако его активность и продукция невелика из-за неблагоприятных условий. На основании этих данных можно получить сравнительную информацию о распределении как самого фитопланктона (F0), так и его фотосинтетической активности (Fv / Fm) по глубине и горизонтальным разрезам в водоемах и рассчитать фотосинтетическую продукцию.
Использование погружной аппаратуры для регистрации параметров флуоресценции хлорофилла показало пространственную неоднородность распределения количества клеток и активности фотосинтеза в популяции фитопланктона. Во многих водоемах максимальная эффективность фотосинтетического аппарата не всегда совпадает с максимумом концентрации фитопланктона, однако коррелирует с обеспеченностью минеральным питанием фитопланктона. Например, в низкопродуктивных районах Тихого океана, Средиземного моря и озера Байкал значения Fv / Fm колебались от 0,3 до 0,5-0,6. В более богатых водах Черного моря активность Fv / Fm возрастала до 0,6. В сильно обогащенных водах северо-западного района Черного моря и залива Котор Адриатического моря активность фитопланктона была характерной для оптимальных условий. С глубиной активность фотосинтеза также меняется, достигая максимума на тех глубинах, где существует приток минеральных солей, а количество проникающего света еще достаточно для фотосинтеза. В тропических водах Тихого океана это наблюдается на глубине 80-120 м. Интересно, что увеличение активности фотосинтеза и появление клеток с высоким значением Fv / Fm предшествует периоду цветения, который сопровождается резким увеличением концентрации фитопланктона в водоемах. Это было обнаружено на озере Байкал и в северо-западном районе Черного моря.
Индукционные кривые флуоресценции, отражающие увеличение интенсивности флуоресценции после начала освещения, является совокупным результатом фотосинтетических процессов в мембранах фотосинтезирующих организмов. В популяции, как правило, могут присутствовать индивидуальные клетки, находящиеся в различных физиологических состояниях, которые связаны с различным уровнем фотосинтеза. Это проявляется в различном уровне флуоресценции, а также в различных формах индукционных кривых разгорания флуоресценции хлорофилла в этих клетках. С помощью микрофлуоресцентного микроскопа можно получить набор различных типов кривых индукции флуоресценции, снятых от одиночных клеток. Набор таких кривых может быть показателем гетерогенного состояния популяции в целом. Не вдаваясь в детальный анализ, отметим, что с помощью статистических методов обработки таких кривых можно построить диаграммы состояния популяции и проследить динамику его изменения. В природных условиях (Черное море) применение этого метода позволяло выявить, как меняется гетерогенный состав популяций в районах с различным уровнем антропогенных загрязнений. Там, где условия наименее благоприятные, преобладают клетки с такими типами индукционных кривых, где имеется высокий уровень флуоресценции, что указывает на низкую эффективность использования света в фотосинтезе.
Замедленная флуоресценция. Другим источником информации о характере функционирования фотосинтетического аппарата является процесс замедленной флуоресценции (ЗФ), обнаруженный Арноном и Стреллером в 1951 году. Это явление состоит в том, что после светового возбуждения в фотосинтезирующих клетках наблюдается слабое (сверхслабое), длительно затухающее свечение, испускаемое хлорофиллом. Такое свечение возникает уже после прекращения флуоресценции (F0) за счет энергии, выделяемой в ходе темновых реакций первичных фотопродуктов фотосинтеза в РЦ. Было показано, что интенсивность ЗФ пропорциональна количеству РЦ в состоянии Р+А1- с разделенными зарядами. Это состояние зависит от скорости последующих стадий переноса электрона. При действии повреждающих факторов на фотосинтетический аппарат концентрация РЦ в состоянии Р+А1-может изменяться. Это позволяет использовать ЗФ для обнаружения загрязнений в различных средах обитания растений.
Искусственный фотосинтез. На сегодня эффективность работы фотосинтезирующих организмов достаточно высока, но есть подходы и перспективы для ее качественного и количественного повышения. Это может быть достигнуто как на пути развития биотехнологических, а возможно и чисто технологических приемов. Пока что попытки создания искусственных систем по преобразованию солнечного света в органические материалы, проводившиеся многими лабораториями мира, не привели к существенным успехам на этом поприще. Функционирование искусственно созданных "молекулярных машин" отличалось нестабильностью или имело крайне низкий коэффициент полезного действия, в результате чего они оказывались экономически невыгодными. В то же время последние достижения в области нанотехнологий позволяют надеяться, что в перспективе можно будет создать эффективно работающие атомно- молекулярные агрегаты по преобразованию света непосредственно в пищевые продукты с заданными свойствами.
Библиография
Веселовский В.А., Веселова Т.В. Люминесценция растений. М., 1990
Владимиров Ю.А., Потапенко А.Д. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М., 1983
Караваев В.А., Кренделева Т.Е. и др. Особенности фотосинтетического аппарата листьев бобов, выращенных на водных растворах хлорида цинка//Биофизика. 2001. Т. 46. Вып. 2
Лукашев Е.П., Сейфуллина Н.Х. Температурная зависимость электроиндуцированного образования "кислой" формы бактериородопсина в пленках пурпурных мембран галобактерий//Биологические мембраны. 2003. Т. 20. № 2
Маторин Д.Н., Венедиктов П.С. Люминесценция хлорофилла в культурах микроводорослей и природных популяциях фитопланктона//Итоги науки и техники. Биофизика. 1990. Т. 40
Рубин А.Б. Первичные процессы фотосинтеза//Соросовский Образовательный Журнал. 1997. № 10
Рубин А.Б. Биофизика: В 2-х т. М., 2000
Рубин А.Б. Биофизические методы в экологическом мониторинге//Соросовский Образовательный Журнал. 2000. № 4
Тихонов А.Н. Трансформация энергии в хлоропластах - энергообразующих органеллах растительной клетки// Соросовский Образовательный Журнал. 1996. № 4
Тихонов А.Н. Регуляция световых и темновых стадий фотосинтеза//Соросовский Образовательный Журнал. 1999. № 11
Шестаков С.В. Молекулярная генетика фотосинтеза// Соросовский Образовательный Журнал. 1998. № 9
Franck F., Juneau P. et al. Resolution of the Photosystem I and Photosystem II contributions to chlorophyll fluorescence of intact leaves at room temperature//Biochim. Biophys. Acta. 2002. № 2
Gust D., Moore T. et al. Mimicking photosynthetic solar energy transduction//Acc. Chem. Res. 2001. № 34 (1)
Wunschiers R., Senger H. et al. Electron pathways involved in H(2)-metabolism in the green alga Scenedesmus obliquus// Biochim. Biophys. Acta. 2001. № 19.
10
Just to say hellow!